Optimisation de la production par voie biotechnologique des alcaloïdes tropaniques à partir de chevelus racinaires de Datura stramonium L.

Abstract

Le matériel végétal utilisé pour ce travail est constitué de chevelus racinaires (CRs) sélectionnés obtenus par transformation génétique in vitro des hypocotyles de Datura stramonium par Agrobaterium rhizogenes (souche A4). Les lignées obtenues sont caractérisées et sélectionnées en fonction de leur croissance, leur réponse à l’élicitation et leur contenu en alcaloïdes totaux. Sur 106 obtenues, quatre lignées seulement ont étés caractérisées dont une seule a été sélectionnée pour la suite du travail. L’utilisation des CRs constitue une des premières voies biotechnologiques pour l’optimisation de la production des alcaloïdes in vitro. Dans ces conditions, les stratégies majeures pour améliorer la productivité en alcaloïdes sont : l’optimisation de la composition du milieu de culture et la stimulation des voies métaboliques secondaires par l’utilisation d’éliciteurs. L’élicitation est largement employée comme une stratégie qui mime l’effet d’un stress, conduisant ainsi à une réponse physiologique rapide de biosynthèse des métabolites secondaires et leur accumulation dans les CRs. L’intensité de cette réponse dépend de la composition du milieu de culture. L’étude de la composition minérale du milieu B5 et de l’élicitation à l’acide jasmonique (AJ) sur la production des alcaloïdes tropaniques des CRs de D. stramonium a été faite selon une approche basée sur la modélisation mathématique. Dans un premier temps, un modèle linéaire mis au point moyennant un plan factoriel 23 a été utilisé pour cribler (screening technique) les éléments les plus influents du milieu B5 sur la réponse à l’élictation. La modélisation des différents effets montre une réponse effective à l’élicitation après le 8ème jour de culture. L’étude des coefficients du modèle révèle que le nitrate [NO3-], le phosphore [H2PO4-] et le calcium [Ca2+] ainsi que les effets combinés de [NO3-/Ca2+] et [NO3-/H2PO4-/Ca2+] sont significativement positifs pour l’élicitation. Les résultats montrent aussi que les CRs limités surtout en [NO3-] montrent une faible réponse à l’élicitation à l’AJ. L’utilisation de ce dernier comme éliciteur est difficile car en améliorant le contenu en alcaloïde, il inhibe en même temps la croissance de la biomasse. La détermination des conditions optimales de l’élicitation requiert donc une considération simultanée de deux réponses : biomasse et production alcaloïdique. Pour obtenir un compromis satisfaisant, une approche par la fonction de désirabilité est proposée. Les résultats obtenus montrent que la concentration de 0.06 mM pour 24h d’élicitation constitue une solution optimale. Elle permet une amélioration de 2.87 fois du contenu en hyoscyamine après le 12ème jour de culture contre une diminution de seulement 12% de la biomasse par rapport aux CRs témoin après 16 jours de culture. Dans ces conditions d’élicitation, l’optimisation de la composition du milieu B5 en [NO3-], en [Ca2+] et en saccharose a été ainsi, réalisée. Dans cette deuxième étape d’optimisation, un modèle quadratique issu de la RSM (Response Surface Methodology) a été mis au point après analyse, diagnostic et accommodation pour l’affinement de son exactitude prédictive. La RSM est actuellement l’une des méthodes les plus utilisées et les plus efficaces pour l’optimisation en réalisant un nombre réduit d’expériences tout en incluant les effets d’interactions entre facteurs. En adoptant cette approche, (application de la RSM), seulement 20 expériences ont été réalisées pour l’optimisation. Ceci constitue un gain de temps considérable. En effet, cette démarche a permis une optimisation du rendement en HS égale de 212.7% pour les CRs élicités de D. stramonium cultivées dans le milieu B5 optimisé par rapport à ceux cultivés dans le milieu B5 témoin (non modifié). Les concentrations optimales dans nos conditions expérimentales sont : 79.1 mM, 11.4 mM et 42.9 mg/l pour respectivement le [NO3-], le [Ca2+] et le saccharose.