Mise au point d'une technique moléculaire de détection de Xanthomonas campestris et validation d'une procédure de détection dans les semences basée sur la PCR

Abstract

Xanthomonas campestris provoque des maladies chez les plantes de la famille des Brassicacées. L’une de ces maladies est la nervation noire. Elle est de distribution universelle et considérée comme la plus destructive des crucifères. Bien que les sources de contamination soient multiples, la semence reste la source principale de la transmission des pathogènes. S’assurer de leur qualité sanitaire est le moyen de lutte le plus efficace contre les bactérioses. Actuellement les techniques officielles adoptées dans les procédures de contrôle des lots de semences sont essentiellement basées sur les techniques microbiologiques. Ces techniques sont longues et coûteuses pour être utilisés en routine. La PCR utilise comme substrat l’ADN qui est une molécule stable, ne rend pas compte de la viabilité des bactéries dans l’échantillon analysé. Le présent travail avait comme objectif de proposer un nouvel outil moléculaire de détection fiable et rapide de Xanthomonas campestris vivant dans les semences de chou. Trois méthodes moléculaires ont été étudiées et testés afin d’évaluer leur potentiel de détection de Xanthomonas campestris dans les semences. La première technique qui a été développée durant cette étude est la RT-PCR. Elle utilise l’ARN comme matrice et permet d’amplifier l’ADNc à partir de l’ARNm cible grâce à une transcription inverse. Des amorces ont été sélectionnés dans quatre gènes rpoD, gyrB, galA et XCC2585, leur seuil de sensibilité et leur potentiel de spécificité ont été testés et comparées.Cette technique a permis de détecter les transcris de deux gènes parmi les quatre gènes candidats testés. Ils’agit du gène rpoD et gyrB. Le gène galA et XCC2585 ne s’exprime pas de manière constitutive. La deuxième partie de notre travail était de valider la méthode BIO-PCR sur des lots de semences naturellement infectées par X. campstris. Cette technique a permis de détecter jusqu'à 10cfu/ml de macérât de semence. La troisième technique que nous avons mise au point pour la détection de X. campestris vivants dans les lots de semences est la SEED-PCR. Cette technique est basée sur un enrichissement par germination des semences contaminées couplée à une Taq-man PCR en temps réel après extraction de l’ADN cible. C’est une technique peu onéreuse et permet de détecter jusqu’au 1 graine contaminée parmi 10 000 graines saines, meme quand la graine est contaminée a un faible niveau.