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    Etablissement d’un procédé biotechnologique pour la production de l’hyoscyamine chez Datura sp.
    (ENSA, 2013-09-09) HARFI, Boualem
    L’hyoscyamine (HS), de par ses propriétés médicinales, est un important alcaloïde tropanique utilisé en médecine humaine et vétérinaire. Dans le but de mettre en place un procédé biotechnologique pour sa production in-vitro, les chevelus racinaires (CRs) de trois espèces du genre Datura issus de la transformation génétique par la souche A4 d’Agrobacterium rhizogenes ont fait l’objet de la présente thèse. Pour ce faire, plusieurs étapes ont été considérées : Tout d’abord, les conditions d’induction des CRs ont été explorées en étudiant l’effet de l’étiolement sur la transformation par l’A. rhizogenes. Ainsi, 247 racines transgéniques issues de vitrosemis étiolés et 96 racines transgéniques issues des vitrosemis non étiolés ont été obtenues. Les vitrosemis étiolés semblent plus favorables à l’induction des CRs que les non étiolés. Ensuite, le travail a porté sur la sélection des lignées de CRs performantes. Sur un total de 343 lignées racinaires induites, trois lignées (1 par espèce) ont été sélectionnées sur la base de leurs performances avérées aussi bien pour la production de biomasse (PS) que de l’HS. Elles ont été retenues pour les étapes suivantes. La cinétique de croissance des CRs et l’accumulation de l’HS révèlent une relation linéaire et une relation exponentielle respectivement pour les lignées sélectionnées du D. stramonium et du D. tatulapendant la phase active de croissance. Mais aussi, un rapport inversement proportionnel entre le PS des CRs et le pic de production de l’HS pour LDT. Pour les trois lignées étudiées, le maximum d’accumulation de l’HS est atteint entre le 20ème et le 22ème jour de culture lorsque le PS des CRs se stabilise. Les résultats de l’effet des acides salicylique (AS) et acétylsalicylique (AAS), éliciteurs de la teneur en HS (TH) des lignées de CRs sélectionnées, révèlent que la concentration optimale des éliciteurs est de 10-4 M à 24 heures d’élicitation. Par ailleurs, la lignée LDT est la plus productive en HS (17.94 mg/g M.S.). La combinaison du temps d’élicitation (2, 4, 6 et 8 jours) et la concentration de ces mêmes éliciteurs (AS et AAS à 10-4, 10-6 et 10-8M) a révélé des résultats encore plus intéressants. La combinaison de la lignée LDT, 10-8M de l’AAS et 8 jours d’élicitation a donné 21,959 mg/g M.S. d’HS. En comparaison avec les teneurs en HS de la plante entière, le meilleur niveau d’amélioration après élicitation est de 40,36 fois (3936 %) obtenu avec la lignée LDI, 10-6M de l’AAS et 8 jours d’élicitation. L’étude de l’effet du KCl et du CaCl2 utilisés comme éliciteurs de la biosynthèse de l’HS avec différents temps d’élicitation révèle des résultats statistiquement significatifs. Les niveaux d’amélioration de la TH par rapport aux témoins non élicités sont respectivement de 2,32, 1,99 et 1,85 fois (132 %, 99 % et 85%) pour les lignées LDS, LDT et LDI élicitées avec le KCl et de 2,08, 2,07 et 1,85 fois (108 %, 107 % et 85 %) pour LDS, LDT et LDI élicitées avec le CaCl2. Par ailleurs, la lignée LDT élicitée avec le CaCl2 est la plus productive en HS (16,978 mg/g M.S.). Les concentrations du Tween 20 testées affectent la viabilité des CRs, puisque nous avons noté des pertes du PS des CRs par rapport aux témoins. La meilleure concentration en l’HS de la solution nutritive est obtenues avec la lignée LDT et 1% de Tween 20. Cette concentration de la solution nutritive en l’HS passe de 40,588 mg/l sans élicitation des CRs à 87,667 mg/l suite à la combinaison de la perméabilisation des CRs et l’élicitation de la production de l’HS. Une augmentation de 2,16 fois (116 %) est alors notée. Enfin, les résultats de la présente étude ont abouti à l’établissement de deux procédés englobant les modalités de production de l’HS in-vitro par les cultures de CRs les plus intéressantes. Un premier procédé en système de culture discontinu et un deuxième procédé en système de culture semi-continu.
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    Induction de chevelus racinaires par Agrobacterium rhizogenes chez Datura sp
    (2009, 2009-03-12) HARFI, Boualem
    Les alcaloïdes tropaniques présentent une grande valeur économique en particulier pour l’industrie pharmaceutique. La culture de chevelus racinaires obtenus par inoculation d’explant de Datura sp avec Agrobacterium rhizogenes offre des perspectives prometteuses pour leur production in-vitro. L’objectif de ce travail est d’essayer d’optimiser cette production. Sur l’ensemble des lignées racinaires obtenues, les lignées retenues sont DT10, DS18, DI3 et DF11 issues respectivement de la transformation génétique des espèces Datura tatula, D. stramonium, D. innoxia et D. ferox. La lignée la plus performante est DT10. Les résultas obtenus montrent que les milieux entiers (MS et B5) donnent les meilleures biomasses, les milieux dilués (½MS, ¾MS, ½B5, ¾B5) sont plus intéressants pour la production des alcaloïdes. Les concentrations 75 mM d’azote et 10 mM de calcium ont donné les poids secs les plus importants. L’essais de l’élicitation de la biomasse révèle que la concentration 10-8 M des acides salicylique (AS), acétylsalicylique (AAS) et jasmonique (AJ) donne les meilleurs poids secs. Quant à l’élicitation de la production de hyoscyamine, c’est la concentration 10-4 M de l’AJ et 10-6 M des AS et AAS qui donne les teneurs les plus élevées. A fin de perméabiliser les chevelus racinaires, un tensioactif (tween20) et du peroxyde d’hydrogène sont utilisés, 1% de tween20 libère dans la solution nutritive plus de 33 mg/l d’hyoscyamine. En utilisant cette dose dans un système de culture semi-continu, la teneur en hyoscyamine obtenue pour la première semaine est de 33,9 mg/l elle chute au-delà de manière significative pour la suite de la culture.